На разных цепях материнской молекулы
Синтез двух дочерних цепей ДНК
А. В связи с антипараллельностью цепей ДНК синтез дочерних цепей идет по-разному,на верхней материнской цепи дочерняя цель синтезируется непрерывно-лидирующая цепь, на нижней материнской цепи дочерняя цепь собирается из фрагментов Оказаки - отстающая цепь
Б. Синтез лидирующих цепей в раэнонаправленных вилках происходит на разных цепях материнской ДНК
Для поддержания главных характеристик клетки или организма на протяжении их жизни, а также в ряду поколений наследственный материал должен отличаться устойчивостью к внешним воздействиям или должны существовать механизмы коррекции возникающих в нем изменений. В живой природе используются оба фактора. Третьим фактором является точность копирования нуклеотидных последовательностей материнской ДНК в процессе ее репликации.
По реакционной способности молекулы ДНК относятся к категории химически инертных веществ. Известно, что роль вещества наследственности может выполнять не только ДНК, но и РНК (некоторые вирусы). Считают, что выбор в пользу ДНК обусловлен ее более низкой по сравнению с РНК реакционной способностью.
Рассмотренный выше механизм репликации отличается чрезвычайно высокой точностью воспроизведения структуры ДНК. При удвоении ДНК ошибки возникают в среднем с частотой 1·10 -6 комплементарных пар оснований.
В поддержании высокой точности репликации важная роль принадлежит прежде всего ферменту ДНК-полимеразе. Этот фермент осуществляет отбор необходимых нуклеотидов из числа имеющихся в ядерном соке нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), точное присоединение их к матричной цепи ДНК и включение в растущую дочернюю цепь. Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1·10 -5 пар оснований.
Такие ошибки в работе ДНК-полимеразы связаны с возникновением измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Например, измененная форма цитозина вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную нарушает его связывание с матрицей, появляется неспаренный 3"-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции , осуществляемый ДНК-полимеразой (или тесно связанным с ней ферментом - редактирующей эндонуклеазой). Самокоррекция заключается в отщеплении ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей. Следствием самокоррекции является снижение частоты ошибок в 10 раз (с 10 -5 до 10 -6).
Несмотря на эффективность самокоррекции, в ходе репликации после удвоения ДНК в ней обнаруживаются ошибки. Особенно часто это наблюдается при нарушении концентрации четырех нуклеозидтрифосфатов в окружающем субстрате. Значительная часть изменений возникает также в молекулах ДНК в результате спонтанно происходящих процессов, связанных с потерей пуриновых оснований - аденина и гуанина (апуринизацией) - или дезаминированием цитозина, который превращается в урацил. Частота последних изменений достигает 100 на 1 геном/сут.
Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием реакционноспособных соединений, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетового излучения, которое может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками тимина в ДНК (димеры тимина). Названные изменения в очередном цикле репликации должны привести либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.
Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной , т.е. с «вырезанием». Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной.
Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание. Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность. При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими - пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК. В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.
Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации. Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи. Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами.
В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система ). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.
Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.
Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апоптоз ) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.
Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10 -9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10 9 нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.
Наследственная информация, записанная с помощью генетического кода, хранится в молекулах ДНК и размножается для того, чтобы обеспечить вновь образуемые клетки необходимыми «инструкциями» для их нормального развития и функционирования. Вместе с тем непосредственного участия в жизнеобеспечении клеток ДНК не принимает. Роль посредника, функцией которого является перевод наследственной информации, сохраняемой в ДНК, в рабочую форму, играют рибонуклеиновые кислоты - РНК.
В отличие от молекул ДНК рибонуклеиновые кислоты представлены одной полинуклеотидной цепью, которая состоит из четырех разновидностей нуклеотидов, содержащих сахар, рибозу, фосфат и одно из четырех азотистых оснований - аденин, гуанин, урацил или цитозин. РНК синтезируется на молекулах ДНК при помощи ферментов РНК-полимераз с соблюдением принципа комплементарности и антипараллельности, причем аденину ДНК в РНК комплементарен урацил. Все многообразие РНК, действующих в клетке, можно разделить на три основных вида: м-РНК, т-РНК, р-РНК.
4.5. Транскрипция –перенос информации с молекулы ДНК на молекулу про-и-РНК. Матрицей для синтеза РНК служит одна из двух цепей ДНК.
Для того чтобы синтезировать белки с заданными свойствами, к месту их построения поступает «инструкция» о порядке включения аминокислот в пептидную цепь. Эта инструкция заключена в нуклеотидной последовательности матричных, или информационных РНК (м-РНК, и-РНК), синтезируемых на соответствующих участках ДНК.
4 стадии:
1) Связывание ДНК-зависимой РНК-полимеразы с промотором . Синтез м-РНК начинается с обнаружения РНК-полимеразой особого участка в молекуле ДНК, который указывает место начала транскрипции - промотора .
2) Инициация. После присоединения к промотору РНК-полимераза раскручивает прилежащий виток спирали ДНК. Две цепи ДНК в этом месте расходятся, и на одной из них фермент осуществляет синтез м-РНК. Сборка рибонуклеотидов в цепь происходит с соблюдением их комплементарности нуклеотидам ДНК, а также антипараллельно по отношению к матричной цепи ДНК.
3) Элонгация – рост цепи РНК. В связи с тем, что РНК-полимераза способна собирать полинуклеотид лишь от 5"-конца к 3"-концу, матрицей для транскрипции может служить только одна из двух цепей ДНК, а именно та, которая обращена к ферменту своим 3"-концом (3" → 5"). Такуюцепь называют кодогенной. Антипараллельность соединения двух полинуклеотидных цепей в молекуле ДНК позволяет РНК-полимеразе правильно выбрать матрицу для синтеза м-РНК.
4) Терминация. Продвигаясь вдоль кодогенной цепи ДНК, РНК-полимераза осуществляет постепенное точное переписывание информации до тех пор, пока она не встречает специфическую нуклеотидную последовательность - терминатор транскрипции. В этом участке РНК-полимеразаотделяется как от матрицы ДНК, так и от вновьсинтезированной м-РНК. Фрагмент молекулы ДНК, включающий промотор,транскрибируемую последовательность и терминатор, образует единицу транскрипции - транскриптон.
В процессе синтеза, по мере продвижения РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, пройденные ею одноцепочечные участки ДНК вновь объединяются в двойную спираль. Образуемая в ходе транскрипции м-РНК содержит точную копию информации, записанной в соответствующем участке ДНК. Тройки рядом стоящих нуклеотидов м-РНК, шифрующие аминокислоты, называют кодонами. Последовательность кодонов м-РНК шифрует последовательность аминокислот в пептидной цепи. Кодонам м-РНК соответствуют определенные аминокислоты.
Схема синтеза мРНК
Для поддержания главных характеристик клетки или организма на протяжении их жизни, а также в ряду поколений наследственный материал должен отличаться устойчивостью к внешним воздействиям или должны существовать механизмы коррекции возникающих в нем изменений. В живой природе используются оба фактора. Третьим фактором является точность копирования нуклеотидных последовательностей материнской ДНК в процессе ее репликации.
Рис. 3. 13. Белки, участвующие в процессе репликации ДНК
ДНК-геликаза расплетает двойную спираль ДНК, разделяя ее полинуклеотидные цепи; дестабилизирующие белки выпрямляют участок цепи ДНК; ДНК-топоизомераза разрывает фосфодиэфирную связь в одной из полинуглеотидных цепей ДНК, снимая напряжение, вызываемое расплетенисм спирали и расхождением цепей в репликационной вилке; РНК-праймаза синтезирует РНК-затравки для дочерней цепи и для каждого фрагмента Оказаки; ДНК-полимераза осуществляет непрерывный синтез лидирующей цепи и синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи; ДНК-лигаза сшивает фрагменты Оказаки после удаления РНК-затравки
По реакционной способности молекулы ДНК относятся к категории химически инертных веществ. Известно, что роль вещества наследственности может выполнять не только ДНК, но и РНК (некоторые вирусы). Считают, что выбор в пользу ДНК обусловлен ее более низкой по сравнению с РНК реакционной способностью.
Рассмотренный выше механизм репликации отличается чрезвычайно высокой точностью воспроизведения структуры ДНК. При удвоении ДНК ошибки возникают в среднем с частотой 1·10 -6 комплементарных пар оснований.
В поддержании высокой точности репликации важная роль принадлежит прежде всего ферменту ДНК-полимеразе. Этот фермент осуществляет отбор необходимых нуклеотидов из числа имеющихся в ядерном соке нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), точное присоединение их к матричной цепи ДНК и включение в растущую дочернюю цепь (см. рис. 3.10). Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1·10 -5 пар оснований.
Такие ошибки в работе ДНК-полимеразы связаны с возникновением измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Например, измененная форма цитозина вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную нарушает его связывание с матрицей, появляется неспаренный 3"-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции , осуществляемый ДНК-полимеразой (или тесно связанным с ней ферментом - редактирующей эндонуклеазой). Самокоррекция заключается в отщеплении ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей (рис. 3.14). Следствием самокоррекции является снижение частоты ошибок в 10 раз (с 10 -5 до 10 -6).
Несмотря на эффективность самокоррекции, в ходе репликации после удвоения ДНК в ней обнаруживаются ошибки. Особенно часто это наблюдается при нарушении концентрации четырех нуклеозидтрифосфатов в окружающем субстрате. Значительная часть изменений возникает также в молекулах ДНК в результате спонтанно происходящих процессов, связанных с потерей пуриновых оснований - аденина и гуанина (апуринизацией) - или дезаминированием цитозина, который превращается в урацил. Частота последних изменений достигает 100 на 1 геном/сут.
Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием реакционноспособных соединений, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетового излучения, которое может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками тимина в ДНК (димеры тимина). Названные изменения в очередном цикле репликации должны привести либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.
Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с «вырезанием» (рис. 3.15). Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной .
Рис. 3.14. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК:
I -включение в цепь ДНК нуклеотида с измененной (таутомерной) формой цитоэина, который «незаконно» спаривается с аденином; II - быстрый переход цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3"-ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему ее удлинению под действием ДНК-полимеразы; III - ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3 "- ОН-конец; IV - ДНК-полимераза продолжает наращивание цепи на 3"-ОН-конце
Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание.
Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность (рис. 3.15).
Рис. 3.15. Схема эксцизионной, дорепликативной репарации ДНК
При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими -пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. (см. разд. 3.4.2.3).
Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК.
В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.
Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация ) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации.
Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи (рис. 3.16). Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами (рис. 3.17).
Рис. 3.16. Схема пострепликативной репарации ДНК:
I - возникновение тиминового димера в одной из цепей ДНК;
II - образование «бреши» во вновь синтезируемой цепи против измененного участка материнской молекулы после репликации (стрелкой показано последующее заполнение «бреши» участком из соответствующей цепи второй дочерней молекулы ДНК);
III - восстановление целостности дочерней цепи верхней молекулы за счет рекомбинации и в нижней молекуле за счет синтеза на комплементарной цепи
Рис. 3.17. Межхроматидные обмены (указаны стрелками)
В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.
Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.
Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апотпоз) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.
Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10 -9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10 9 нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.
Под действием алкилирующих агентов, например N-метил-гТГ-нитрозомочевины или Ч^гЧ-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образуются О 6 -метил - или О 6 -алкилзамещенные гуаниновые остатки. Такие модифицированные остатки гуанина могут деалкилироваться при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и млекопитающих. О 6 -метилгуанин-ДНК-алкилтрансфераза катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Содержание алкилтрансферазы в клетках Е. coli увеличивается в присутствии О 6 -алкилгуанина, но в клетках млекопитающих аналогичной индуцибельности не наблюдается.
При облучении ДНК ультрафиолетовым светом в ней образуются циклобутановые димеры между соседними пиримидиновыми основаниями. Такие соединения блокируют репликацию ДНК, и для сохранения жизнеспособности клетки их необходимо удалить. Один из способов удаления пиримидиновых димеров состоит в ферментативном превращении их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Такие фотореактивирующие ферменты имеются у бактерий и низших эукариотических организмов, но в клетках млекопитающих они не обнаружены. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и, используя энергию поглощенного им света, разрушает димер без разрыва цепей ДНК.
б. Репарация путем замены модифицированных остатков
Замена модифицированного нуклеотида обычно происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Во-вторых, экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь. В-третьих, удаленный участок синтезируется заново с 3-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи. В-четвертых, концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи.
Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация, выщепляются ферментами, называемыми АР-эндонуклеазами. В клетках про - и эукари - от имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз, часто по нескольку разных типов. Некоторые АР-эндонуклеазы надрезают цепь с 3"-стороны АР-сайта, а другие расщепляют диэфирную связь с 3"-сто-роны; в любом случае образуются 3"-гидроксильный и 5"-фосфорильный концы. Разрыв фосфодиэфирной связи по одну или другую сторону от места нарушения позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны сайта расщепления и затем ресинтезировать удаленную последовательность.
В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют специфические N-гликозилазы - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между модифицированными основаниями и дезоксирибозой. N-гликозилазы используются и при коррекции нарушений, состоящих в спонтанном дезамини-ровании цитозина или аденина и превращении их соответственно в урацил или гипоксантин. Ферменты урацил-гликозилаза и гипоксантин-гликозилаза выщепляют из ДНК соответственно урацил и гипоксантин, оставляя пробелы в месте выщепления. И вновь с помощью механизма выщепления-ресинтеза восстанавливается исходная последовательность поврежденной цепи.
Урацил-гликозилаза играет очень важную антимутагенную роль и при исправлении ошибок, происходящих при использовании во время репликации dUTP вместо dTTP. Поскольку спаривание dUMP с матрицей происходит почти так же хорошо, как и dTMP, Pol III его не распознает, и если dUMP не подвергается специфическому выщеплению, то при последующем раунде репликации в новую цепь может включиться dGMP. Таким образом, г-гликозилаза защищает клетки от возможных мутагенных последствий включения в цепь ДНК dUMP.
Репарация тиминовых димеров может происходить и в темноте одним из следующих двух способов. В клетках Е. coli синтезируются три полипептида, кодируемые генами uvrA, uvrB и uvrC, которые образуют ферментный комплекс uvrЛВC-эндонуклеазу. Этот фермент разрезает цепь ДНК, содержащую пиримидиновый димер, на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5"-стороны и четырех или пяти связей с 3"-стороны пиримидинового димера. Удаление поврежденного участка, по-видимому, катализируется геликазой, кодируемой еще одним геном, uvrD. В результате удаляется тиминовый димер и еще примерно 12 окружающих его нуклеотидов. Образовавшийся пробел заполняется с помощью Pol I, а ДНК-лигаза завершает репарацию, соединяя два соседних основания цепи. Некоторые организмы используют для репарации повреждений, возникающих при образовании пиримидиновых димеров, другой механизм. Репарация осуществляется при участии пиримидиновый димер-г-гликозилазы, которая создает апиримидиновый сайт. Гликозидная связь между одним из тиминов и дезоксирибозой разрезается так, что тиминовый димер остается на 5"-конце разорванной цепи, а 3"-ОН-группа - на дезоксирибозе. Образовавшийся 3"-АР-конец отщепляется с помощью 3"-5"-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а затем путем ник-трансляции и лигирования удаляется нуклеотид вместе с прилежащим тиминовым димером, заполняется образовавшийся пробел и сшиваются концы цепи.
в. Значение репарации ДНК
У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации или рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, а том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клетки Е. coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительны к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток Е. coli, дефектных по Pol I, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.
У представителя низших эукариот Saccharomyces cerevisiae имеется по крайней мере пять генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих пяти RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно, и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.
Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к ультрафиолетовому свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.
пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.
Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с «вырезанием» (рис. 3.15). Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также
дорепликативной.
Рис. 3.14. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК: I -включение в цепь ДНК нуклеотида с измененной (таутомерной) формой цитоэина, который «незаконно» спаривается с аденином; II - быстрый переход
цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3"- ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему ее удлинению под действием ДНК-полимеразы; III - ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3 "- ОН-конец; IV - ДНК-полимераза продолжает наращивание цепи на 3"-ОН-конце
Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание.
Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность (рис. 3.15).
Рис. 3.15. Схема эксцизионной, дорепликативной репарации ДНК При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной
структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими -пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. (см. разд. 3.4.2.3).
Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК.
В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация
этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.
Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация ) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации.
Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи (рис. 3.16). Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами (рис. 3.17).
Рис. 3.16. Схема пострепликативной репарации ДНК: I - возникновение тиминового димера в одной из цепей ДНК;
II - образование «бреши» во вновь синтезируемой цепи против измененного участка материнской молекулы после репликации (стрелкой показано последующее заполнение «бреши» участком из соответствующей цепи второй дочерней молекулы ДНК);
III - восстановление целостности дочерней цепи верхней молекулы за счет рекомбинации и в нижней молекуле за счет синтеза на комплементарной цепи
Рис. 3.17. Межхроматидные обмены (указаны стрелками)
В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.
Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.
Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апотпоз) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.
Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10-9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 109 нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.
3.4.2.3. Изменения нуклеотидных последовательностей ДНК. Генные мутации
Нескорректированные изменения химической структуры генов, воспроизводимые в последовательных циклах репликации и проявляющиеся у потомства в виде новых вариантов признаков, называют генными мутациями.
Изменения структуры ДНК, образующей ген, можно разделить на три группы. Мутации первой группы заключаются в замене одних оснований другими. Они составляют около 20% спонтанно возникающих генных изменений. Вторая группа мутаций обусловлена сдвигом рамки считывания, происходящим при изменении количества нуклеотидных пар в составе гена. Наконец, третью группу представляют мутации, связанные с изменением порядка нуклеотидных последовательностей в пределах гена (инверсии).
Мутации по типу замены азотистых оснований. Эти мутации происходят в силу ряда конкретных причин. Одной из них может быть возникающее случайно или под влиянием конкретных химических агентов изменение структуры основания, уже включенного в спираль ДНК. Если такая измененная форма основания остается не замеченной ферментами репарации, то при ближайшем цикле репликации она может присоединять к себе другой нуклеотид. Примером может служить дезаминирование цитозина, превращающегося в урацил самопроизвольно или под влиянием азотистой кислоты (рис. 3.18). Образующийся при этом урацил, не замеченный ферментом ДНК-гликозилазой, при репликации соединяется с аденином, который впоследствии присоединяет тимидиловый нуклеотид. В результате пара Ц-Г замещается в ДНК парой Т-А (рис. 3.19, I ). Дезаминирование метилированного цитозина превращает его в тимин (см. рис. 3.18). Тимидиловый нуклеотид, являясь естественным компонентом ДНК, не обнаруживается ферментами репарации как изменение и при следующей репликации присоединяет адениловый нуклеотид. В результате вместо пары Ц-Г в молекуле ДНК также появляется пара Т-А (рис. 3.19, II ).
Рис. 3.18. Спонтанное дезаминирование цитозина
Другой причиной замены оснований может быть ошибочное включение в синтезируемую цепь ДНК нуклеотида, несущего химически измененную форму основания или его аналог. Если эта ошибка остается не замеченной ферментами репликации и репарации, измененное основание включается в процесс репликации, что нередко приводит к замене одной пары на другую. Примером этого может служить присоединение в ходе репликации к аденину материнской цепи нуклеотида с 5-бромурацилом (5-БУ), аналогичного тимидиловому нуклеотиду. При последующей репликации 5-БУ охотнее присоединяет к себе не аденин, а гуанин. Гуанин в ходе дальнейшего удвоения образует комплементарную пару с цитозином. В итоге пара А-Т заменяется в молекуле ДНК парой Г-Ц (рис. 3.20).
Рис. 3. 19. Мутации по типу замены основания (дезаминирование азотистых оснований в цепи ДНК):
I - превращение цитозина в урацил, замена Ц-Г-пары на Т-А-пару;
II - превращение метил- цитозина в тимин, замена Ц-Г-пары на Т-А-пару
Из приведенных примеров видно, что изменения структуры молекулы ДНК по типу замены оснований возникают либо до, либо в процессе репликации первоначально в одной полинуклеотидной цепи. Если такие изменения не исправляются в ходе репарации, то при последующей репликации они становятся достоянием обеих цепей ДНК.
Рис. 3.20. Мутации по типу замены оснований
(включение аналога азотистого основания при репликации ДНК)
Следствием замены одной пары комплементарных нуклеотидов на другую является образование нового триплета в нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей последовательность аминокислот в пептидной цепи. Это может и не отразиться на структуре пептида в том случае, если новый триплет будет «синонимом» прежнего, т.е. будет кодировать ту же аминокислоту. Например, аминокислота валин шифруется четырьмя триплетами: ЦАА, ЦАГ, ЦАТ, ЦАЦ. Замена третьего основания в любом из этих триплетов не изменит его смысла (вырожденность генетического кода).
В том случае, когда вновь возникший триплет шифрует другую аминокислоту, изменяются структура пептидной цепи и свойства соответствующего белка. В зависимости от характера и места случившейся замены специфические свойства белка изменяются в разной степени. Известны случаи, когда замена лишь одной аминокислоты в пептиде существенно влияет на свойства белка, что проявляется в изменении более сложных признаков. Примером может служить изменение свойств гемоглобина человека при серповидно-клеточной анемии (рис. 3.21). В таком гемоглобине-(HbS) (в отличие от нормального НbА) - в р-глобиновых цепях в шестом положении глутаминовая кислота заменена валином. Это является следствием замены одного из оснований в триплете, шифрующем глутаминовую кислоту (ЦТТ или ЦТЦ). В результате появляется триплет, шифрующий валин (ЦАТ или ЦАЦ). В данном случае замена одной аминокислоты в пептиде существенно изменяет свойства глобина, входящего в состав гемоглобина (снижается его способность связываться с 02), у человека развиваются признаки серповидноклеточной анемии.
В некоторых случаях замена одного основания на другое может привести к появлению одного из нонсенс-триплетов (АТТ, АТЦ, АЦТ), не шифрующего никакой аминокислоты. Последствием такой замены будет прерывание синтеза пептидной цепи. Подсчитано, что замены нуклеотидов в одном триплете приводят в 25% случаев к образованию триплетов-синонимов; в 2-3 -бессмысленных триплетов, в 70- 75% -к возникновению истинных генных мутаций.
Таким образом, мутации по типу замены оснований могут возникать как в результате спонтанных изменений структуры основания в одной из цепей уже существующей двойной спирали ДНК, так и в ходе репликации во вновь синтезируемой цепи. В том случае, если эти изменения не исправляются в процессе репарации (или, наоборот, возникают в ходе репарации), они фиксируются в обеих цепях и далее будут воспроизводиться в следующих циклах репликации. Следовательно, важным источником возникновения таких мутаций являются нарушения процессов репликации и репарации.
Мутации со сдвигом рамки считывания. Этот тип мутаций составляет значительную долю спонтанных мутаций. Они происходят вследствие выпадения или вставки в нуклеотидную последовательность ДНК одной или нескольких пар комплементарных нуклеотидов. Большая часть изученных мутаций, вызывающих
Оглавление темы "Генетические элементы бактерий. Мутации у бактерий. Трансдукция.":1. Мигрирующие генетические элементы бактерий. Транспозоны. Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы.
2. Мутация. Мутации у бактерий. Мутагены. Спонтанные мутации. Обратные мутации (реверсии).
3. Индуцированные мутации бактерий. Химический мутагенез. Радиационный мутагенез. Типы мутаций.
4. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.
5. Перенос бактериальной ДНК. Конъюгация бактерий. F-фактор бактерии.
6. Трансформация бактерий. Стадии трансформации бактерии. Картирование хромосом бакетерий.
7. Трансдукция. Неспецифическая трансдукция. Специфическая трансдукция. Абортивная трансдукция. Феномен лизогении.
8. Свойства бактерий. Ненаследуемые изменения свойств бактерий. S - колонии. R - колонии. M - колонии. D - колонии бактерий.
Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.
В клетке существуют механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру изменённой ДНК. Мутации, вызванные радиацией, химическими веществами и другими факторами, теоретически могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, если бы последняя была лишена способности к репарации ДНК . Совокупность ферментов, катализирующих коррекцию повреждений ДНК, объединяют в так называемые системы репарации, принципиально различающиеся по биохимическим механизмам «залечивания» повреждений. Известно три основных направления коррекции дефектов ДНК.
1. Непосредственная реверсия от повреждённой ДНК к исходной структуре, когда изменения в ДНК исправляются с помощью единственной ферментативной реакции. Например, удаление неправильно присоединённой метильной группы при шестом атоме кислорода гуанина с помощью метилтрансферазы; или расщепление возникшего в результате облучения тиминового димера с помощью фотолиазы (рекомбинационная репарация ).
2. «Вырезание» повреждений с последующим восстановлением исходной структуры (эксцизионная репарация).
3. Активация особых механизмов , обеспечивающих выживание при повреждениях ДНК (восстановление исходной структуры ДНК в результате рекомбинации; коррекция ошибочного спаривания оснований; трансляционный синтез на повреждённой матрице ДНК ). Эти механизмы не всегда приводят к полному восстановлению исходной структуры ДНК.
Компенсация функций, нарушенных в результате мутаций
Первичная мутация может быть компенсирована вторичной мутацией, которая произошла внутри мутировавшего гена (интрагенно) или в другом гене (экстрагенно). Изменения, которые устраняют проявления мутации, не исправляя при этом первоначального нарушения в ДНК , называют супрессией .
Интрагенная супрессия вызвана вторичной мутацией, корригирующей эффекты первичной мутации. Например, точечная мутация, приводящая к синтезу дефектного белка с утраченной биологической активностью, может быть исправлена, если вторичная точечная мутация приведёт к кодированию аминокислоты, сохраняющей конфигурацию и активность белка. Точное восстановление исходной структуры гена называют истинной обратной мутацией (истинной реверсией ). Если эффект первой мутации компенсирован мутацией в другой части гена, такие мутации называют вторичными реверсиями.
Экстрагенная супрессия - подавление проявления мутации, произошедшей в одном гене, вследствие мутации во втором гене.