В микробиологии окраска по Граму имеет большое значение. Ее применяют для диагностики инфекционных заболеваний, выявления патогенности бактерий. Метод позволяет определить сходные по форме и размеру бактерии, которые относятся к различным видам и родам.
Окраска бактерий по Граму - сложный метод, в котором применяют два вида окраса: основной и дополнительный. В процессе выполнения манипуляции применяют обесцвечивающие вещества, к которым относятся спирты и кислоты.
В микробиологии окраску по Граму проводят трифенилметановой группой красителей. К ней относятся генциановые, метиловый синий, кристаллвиолет. Разные виды бактерий дают разные окрасы, образуя прочные соединения с красителями.
Окрасы
В микробиологии окраска по Граму бывает двух видов: грамположительная и грамотрицательная. В первом случае микроорганизмы дают прочные соединения с красителями и йодом. Во время анализа они не обесцвечиваются при воздействии со спиртом, из-за чего не изменяют своего первоначального фиолетового оттенка.
Грамотрицательные окрасы образуются при воздействии с йодом и легко разрушаются под действием йода. В результате микробы обесцвечиваются, а затем приобретают красный оттенок.
Подготовка материала
По правилам микробиологии, окраска по Граму требует предварительной подготовки материалов. Его необходимо распределить тонким слоем по поверхности стекла. Затем мазок подсушивают и после полного высыхания фиксируют. При этом мазок закрепляется на стекле, что позволяет исключить смывание бактерий красителями. К тому же мертвые микроорганизмы окрашиваются лучше, чем живые.
После подготовки материала подбирают метод окрашивания: физический или химический. Первый предполагает воздействие высокой температуры на микробную клетку. Во время химического способа применяют различные химические вещества, которые вызывают коагуляцию протеинов цитоплазмы.
Подготавливают набор для окраски по Граму, предметные стекла с бактериями. Их берут пинцетом или аккуратно пальцами за ребра мазком вверх, затем проводят пару раз над верхом пламени горелки. Процесс должен занимать пару секунд.
Процесс фиксации химическим методом предполагает использование ацетона, спирта, специальных смесей, жидкость Карнуа. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в фиксирующее вещество на пятнадцать минут, затем просушивают на воздухе.
Окрашивание
Окраска мазков по Граму проводится по определенному алгоритму.
- Сначала на фиксированный мазок наносят основной краситель на пару минут. Во избежание появления осадка процедуру выполняют с использованием фильтровальной бумаги.
- Краситель удаляется (сливается), убирается бумага. Мазок погружается в раствор Люголя на две минуты или в йодистый раствор по Граму до почернения препарата.
- Мазок поласкают спиртовым раствором или ацетоном, наливая и сливая его до тех пор, пока и мазок не обесцветится, и жидкость не станет чистой. Это занимает примерно от 30 до 60 секунд.
- Стекла тщательно промывают дистиллированной водой.
Чтобы определить, есть ли в мазке грамотрицательные бактерии, проводят дополнительно окрашивание фуксином или сафранином. Препараты наносят на две минуты. В конце процедуры стекло промывают, высушивают.
Результаты
Все грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный. Шарообразные формы обычно относятся к грамположительным видам, а извитые формы - отрицательно окрашиваются. Палочковидные бактерии могут быть грамотрицательными и грамположительными.
Чтобы получить максимально достоверные результаты исследований, рекомендуется применять суточные культуры, а также свежеприготовленные растворы для окрашивания.
Механизм окраски позволяет увидеть и оценить физико-химические особенности строения цитоплазмы, клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. У первых содержится много рибонуклеиновой кислоты, белков в цитоплазме, а в клеточных стенках - пептидогликана. Из-за этого во время обработки мазков генцианвиолетом и Люголем у грамположительных видов бактерий образуется прочное соединение ионов йода и красителя.
При обработке спиртами грамположительные микроорганизмы удерживают краситель, а грамотрицательные - обесцвечиваются и окрашиваются дополнительно разведенным фуксином в красный оттенок. Некоторые бактерии способны окрашиваться только на стадии роста.
Применение
Окраску по Граму проводят при анализе вида микроорганизмов в мазках из влагалища и слюны. Этот способ позволяет определить вид микроорганизмов в кале, в плевральной, перитонеальной жидкости и не только. Любые жидкости, где могут содержаться бактерии, исследуют данным методом. После проведения окрашивания врачи подбирают метод лечения, назначая препараты, способные воздействовать на грамположительные или грамотрицательные бактерии.
Микробиология. Окраска по Граму: красители, проведение, результаты — все о путешествиях на сайт
Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и химического состава грамположительных и грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий на поверхности клеток есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, которые прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грамположительные бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в котором после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.
У грамотрицательных бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.
Методика окраски по Граму
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1 мин.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Препарат промывают водой.
5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
Этапы окраски по Граму представлены на стенде.
Конец работы -
Эта тема принадлежит разделу:
Изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки
Студент должен иметь представление.. о механизмах окраски структурных компонентов бактерий клеточной стенки.. работа изучение строения бактериальной клетки и структуры клеточной стенки..
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:
Что будем делать с полученным материалом:
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
| Твитнуть |
Все темы данного раздела:
Морфология прокариот. Методы выявления: окраска, микроскопия
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с методами приготовления и окрас
Морфология прокариот
Цель:сравнить формы и размеры микроорганизмов на примере кишечной палочки, стафилококка и гриба кандиды (см. теоретическую справку).
Самостоятельна
Морфология прокариот
Бактерии - это одноклеточные прокариоты растительного происхождения, но лишенные хлорофилла. Видны в световой микроскоп, размеры их измеряются в микрометрах. Размножение происходит
Техника приготовления препаратов-мазков, их фиксация и окраска
Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.
1 этап. О
Методы окраски
Простые методы (ориентировочные)
Сложные методы (дифференцирующие)
1. Применяют для изучения морфологии микроорганизмов.
2. Окрашивают одним кр
Окраска по Цилю-Нильсену
Применяют для дифференциации кислотоустойчивых и некислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость бактерий обусловлена повышенным содержанием в клеточной стенке и цитоплазме липидов,
Окраска по Ожешко
Метод основан на принципе окраски кислотоустойчивых бактерий. Отличие заключается в предварительной обработке микроорганизмов 0,5 % раствором соляной кислотой, что облегчает окраску спор карболовым
Окраска по Романовского-Гимза
Методика окраски по Романовскому-Гимзе:
Краска Романовского-Гимза состоит из метиленового синего, эозина и азура.
1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 ка
Самостоятельная работа во внеурочное время
1. Дайте определение:
а) морфологические свойства - __________________________________________________
____________________________________________________________________________
Окраска бактерий по Граму имеет важное диагностическое значение. Бактерии, прочно удерживающие окраску по Граму, получили название грамположительных. Бактерии, не окрашивающиеся по Граму, называются грамотрицательными.
Для окраски бактерий по Граму необходимы следующие реактивы.
Смесь в бутылке ставится в термостат на 24 час (можно и больше). Затем краску фильтруют.
В 5 мл дистиллированной воды растворяют йодистый калий, потом добавляют йод (2 г) и доводят объем дистиллированной водой до 300 мл. Раствор Люголя необходимо защищать от света, поэтому его надо хранить в склянках бурого стекла и в прохладном месте. Под влиянием света и тепла образуется йодная кислота и раствор становится негодным для употребления. Проконтролировать раствор Люголя можно при помощи лакмусовой бумажки. Если обнаруживается кислая реакция, то такой раствор надо нейтрализовать двууглекислой содой.
Окраска по Граму производится следующим образом:
- на фиксированный огнем мазок наносят генциан или кристалл-виолет на 0,5–1 мин;
- сливают краску и, не промывая водой, на препарат наливают раствор Люголя на 1 мин до полного почернения мазка;
- сливают люголевский раствор и наливают 95°-ный спирт на 0,5–1 мин, причем препарат надо покачивать и сменять спирт до тех пор, пока он не станет бесцветным; промывают водой;
- дополнительно окрашивают фуксином Пфейфера, сафранином или везувином в течение 2–3 мин.
- сливают краску, промывают водой и высушивают мазок, ставя стекло набок.
Способ окраски по Граму требует точного соблюдения времени при обработке препарата различными жидкостями. Особенно это относится к спирту. При более продолжительном, чем нужно, сроке все бактерии обесцветятся, при недостаточном – препарат окажется перекрашенным. Надо также помнить, что время действия краски, протравы и спирта зависит от толщины мазка: толстый мазок надо дольше красить и дольше обесцвечивать. Неравномерный мазок будет и неравномерно краситься, что может дать повод к неправильному заключению. Все это свидетельствует о необходимости хорошо и уверенно владеть техникой приготовления мазков и их окрашивания. Во избежание ошибок, которые иногда происходят при окраске по Граму, в литературе предлагается внести некоторые видоизменения в методику. В числе их можна назвать методику, предложенную Саватеевым для медицинской практики. Сущность ее заключается в том, что после окраски препарата генциан-виолетом и обработки раствором Люголя применяется отмывка не чистым спиртом, а спиртом с добавлением йода, под действием которого бактерии приобретают постоянный необесцвечивающийся темно-лиловый цвет (спирт по Саватееву – 50 мл спирта + 5 мл 5%-ной йодной настойки).
В литературе описано несколько модификаций методов окраски по Граму, из которых мы приведем лишь некоторые.
1. Окраска мазков по Граму, видоизменнная А. Синевым (1930):
а) на зафиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную 1%-ным спиртовым раствором кристалл-виолета;
б) наносят на бумажку две-три капли воды и оставляют на 2 мин;
в) снимают бумажку и наливают раствор Люголя;
г) обесцвечивают спиртом или ацетоном;
д) докрашивают фуксином Пфейфера.
Мазки получаются четкие и без осадка.
Для приготовления бумажек нарезают длинные полосы фильтровальной бумаги шириной 3 см, окрашивают и развешивают на веревке для просушки. Когда бумага хорошо подсохнет, ее нарезают кусочками по величине предметных стекол, складывают в банки и сохраняют впрок.
2. Модификация метода Грама по Хакеру (1921). Необходимые следующие реактивы:
а) кристаллический фиолетовый Хакера (с щевелевокислым аммонием).
Раствор А – кристаллического фиолетового (90% содержания краски) 2 г, этилового спирта (95%-ного) 20 мл.
Раствор Б – аммония щавелевокислого 0,8 г, дистиллированной воды 80 мл.
Растворы А и Б смешивают;
б) раствор Люголя в модификации Грама (йода кристаллического 1 г, йодистого калия 2 г, воды дистиллированной 300 мл).
в) раствор сафранина для докрашивания: сафранина (2,5% в 95%-ном этиловом спирте) 10 мл, дистиллированной воды 100 мл.
Препараты окрашивают в течение 1 мин кристаллическим фиолетовым (со щавелевокислым аммонием), промывают водопроводной водой не более 2 сек, наливают раствор Люголя и оставляют на 1 мин, затем промывают водой и высушивают. Докрашивают в течение 10 сек раствором сафранина, затем промывают водопроводной водой, высушивают, и исследуют.
3. А. В. Коронный (1959) рекомендует ускоренный метод окраски по Граму – окрашивание генциан-виолетом, обработка 5%-ным раствором фенола и обработка раствором Люголя и докрашивание карболовым фуксином Циля сокращается до 5 сек на каждый процесс. Обесцвечивание спиртом – 15 сек.
4. Окраска по Граму в модификации Г.П. Калины (1961). На предметное стекло наносят небольшую каплю дистиллированной воды и вносят в нее минимальное количество бактериальных клеток. Суспензию смешивают с петлей полупроцентного спиртового раствора кристаллического фиолетового, распределяют равномерно по площади 1 см2, подсушивают и фиксируют однократным проведением через пламя. После этого препарат в течение 1 мин обрабатывают следующим реактивом; 5%-ного раствора фуксина 10 мл, 10%-ного раствора йода 10 мл, ацетона 10 мл и 0,5%-ного спиртового раствора йодистого калия 70 мл. Опускают препарат на одно мгновение в этиловый спирт и быстро высушивают фильтровальной бумагой.
5. Окраска по Граму в модификации К.М. Бартона (1962). Применение ацетона дает более чистые препараты. Дополнительная окраска фуксином менее эффективна. Наиболее контрастным дополнительным красителем является смесь Сандифорда – 0,05 г малахитового зеленого, 0,15 г пиронина и 100 мл дистиллированной воды.
Окраска по Граму – основной метод окраски в бактериологии. С окраски по Граму начинается описание морфологических свойств. Такое значение этого метода обуславливается тем, что окраска бактериальной клетки по Граму зависит от типа строения её клеточной стенки и, соответственно, принадлежности к отделу Firmicutes или Gracilicutes – первого этапа идентификации любого вида в бактериологии. Окраска по Граму осуществляется в четыре этапа.
А. На первом этапе фиксированный мазок окрашивается генциановым фиолетовым.
1. Окрашивание продолжается 1 – 2 минуты.
2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии окрашиваются этой краской в синий цвет.
Б. На втором этапе мазок обрабатывается раствором Люголя, который формирует с генцианвиолетом красящий комплекс, локализующийся на цитоплазматической мембране.
1. Обработка раствором Люголя продолжается 1 – 2 минуты.
2. И грамположительные и грамотрицательные бактерии на этом этапе остаются синими.
В. На третьем этапе мазок обесцвечивается спиртом.
1. Обесцвечивание спиртом продолжается примерно 20 секунд с последующим обильным промыванием водой.
2. Грамположительные бактерии за это время не успевают обесцветиться и остаются синими, а грамотрицательные, вследствие более тонкого слоя пептидогликана, препятствующего вымыванию спиртом красящего комплекса, обесцветиться успеют и, следовательно, станут бесцветными.
Г. На четвертом этапе мазок окрашивается водным фуксином или другой красной краской – сафранином.
1. Докраска красной краской продолжается 1 – 2 минуты. Причем, этот этап лучше продлить подоль-ше, так как после обесцвечивания бактериальная клеточная стенка воспринимает краску хуже, чем обычно.
2. Грамположительные бактерии остаются синими, так как они уже окрашены более темной краской а грамотрицательные, которые на предыдущем этапе обесцветились, на этом этапе окрашиваются в красный цвет. Д. Грамположительные бактерии составляют меньшую часть тех бактерий, которые изучает меди-цинская микробиология. Ниже приводятся основные (этот перечень будет позже добавлен неспорооб-разующими анаэробами).
1. Грамположительными являются большинство кокков (кроме нейссерий): стафилококки, стрепто-кокки и пневмококки, энтерококки.
2. Среди палочек грамположительными являются листерии, бактерии актиномицетного ряда (актино-мицеты, микобактерии, коринебактерии), спорообразующие палочки (бациллы и клостридии).
Е. Большинство бактерий, имеющих медицинское значение, грамотрицательные. Лишь по отношению к микоплазмам не корректно говорить об их грамотрицательности (хотя по Граму они окрашивались бы в розовый цвет – если бы их так окрашивали, так как на практике этот метод в изучении микоплазм не применяется). Дело в том, что грамоложительные и грамотрицательные бактерии отлича-ются друг от друга типом клеточной стенки (прежде всего – количеством содержащегося в ней пепти-догликана), а у микоплазм клеточной стенки с содержанием пептидогликана нет.
1. Из кокков грамотрицательные – нейссерии.
2. Грамотрицательными являются большинство палочек (собственно все, за исключением перечисленных выше грамположительных).
3. Клеточную стенку грамотрицательного типа имеют также спирохеты.
Это основной способ, использующийся в бактериологии .
Основан на реакции основного парарозанилинового красителя (например, кристаллического фиолетового, метилового фиолетового или их смеси, так называемого генцианвиолета) с йодом.
Продуктом этой реакции является нерастворимое соединение темно-красного цвета в клеточной стенке бактерий. Это вещество удаляется обесцвечивающими растворителями (такими, как ацетон или спирт). Степень обесцвечивания зависит от структуры и толщины клеточной стенки.
Для демонстрации обесцвеченных микроорганизмов используют более светлый докрашивающий краситель.
Грамположительные микроорганизмы устойчивы к обесцвечиванию и остаются темно-пурпурными. Эта устойчивость не постоянна, и при продолжительном обесцвечивании краситель все же смывается.
Грамотрицательные микроорганизмы , как и весь цитологический препарат, окрашиваются в розовый цвет.
В культурах и образцах, содержащих грамположительные микроорганизмы, может содержаться какое-то количество грамотрицательных клеток, особенно если образцы старые.
В литературе описано 4 различных схемы окраски по Граму . Ключевыми моментами являются только порядок добавления реагентов, время обесцвечивания и тщательное удаление всех реагентов.
Существуют готовые наборы для окраски по Граму , к которым должна прилагаться инструкция от производителя.
Методика
 |
1. Зафиксируйте мазок, проведя его несколько раз над пламенем
2. Залейте мазок 0,5% метиловым фиолетовым или 1% кристаллическим фиолетовым и оставьте на 1 минуту
3. Смойте водой
4. Залейте мазок 1% йодным раствором люголя и оставьте на 1 минуту
5. Смойте водой
6. Залейте 95% спиртом и осторожно покачайте, пока краска не перестанет смываться с мазка. Это займет не менее 30 секунд. Если мазок очень толстый, можно добавить свежий спирт для ускорения обесцвечивания.
7. Промойте стекло однократно водой
8. Покрасьте мазок 0,5% основным фуксином в течение 30 секунд, 0,1% нейтральным красным в течение 2 минут, или 0,5% сафранином в течение 10 секунд.
Примечания
- Для обесцвечивания можно использовать ацетон. Он действует быстрее, чем спирт (2 секунд бывает достаточно), но есть опасность слишком сильного обесцвечивания.
- Ацетон более опасен при попадании на кожу или на одежду.